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如何選購(gòu)適合自己的熒光定量PCR儀

更新時(shí)間:2019-09-29      點(diǎn)擊次數(shù):1656

二手熒光定量PCR儀因操作方便、運(yùn)行速度快、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,受到越來(lái)越多的分子生物學(xué)研究者青睞。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟的今天,也許對(duì)你來(lái)說(shuō),其難點(diǎn)不是實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的問(wèn)題——而是 如何選購(gòu)適合自己的熒光定量PCR儀 ——你要征詢實(shí)驗(yàn)室成員的意見(jiàn)、分析實(shí)驗(yàn)室目前乃至將來(lái)的需求、平衡實(shí)驗(yàn)室的預(yù)算,更要詳細(xì)研究各種極富誘huo力的宣傳資料。面對(duì)各種不同性能的產(chǎn)品,您又該如何選擇呢?

 

首先建議大家走出認(rèn)識(shí)二手熒光定量PCR儀的兩個(gè)誤區(qū):

 

誤區(qū)一:儀器通道越多越好

 

隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用,多重?cái)U(kuò)增越來(lái)越熱鬧,二手熒光定量PCR儀儀也不能幸免。從初期ABI公司推出的單通道二手熒光定量PCR儀儀發(fā)展到如今各個(gè)廠家都推出4通道、5通道甚至6通道二手熒光定量PCR儀儀,眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從,就有人一不小心走進(jìn)了“通道越多越好”的誤區(qū)。

 

在使用有些廠家5通道的熒光定量?jī)x時(shí),為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX(一種熒光染料)或的Referencedye,這些熒光染料都應(yīng)單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道。這樣以來(lái),能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè),而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本。有的二手熒光定量PCR儀的檢測(cè)通道是只為自已廠家的的熒光染料或試劑開(kāi)放的,有效檢測(cè)通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購(gòu)買(mǎi)前確認(rèn)二手熒光定量PCR儀儀器的有效檢測(cè)通道尤為重要,不能單單只聽(tīng)宣傳。

 

考慮多重二手熒光定量PCR儀的通道數(shù)的時(shí)候也應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況出發(fā),多重PCR并非人人適用、人人可用,因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化了,況且大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室熒光定量實(shí)驗(yàn)常年只使用SYBRGreen一種染料,實(shí)在沒(méi)有必要選購(gòu)更多通道。

 

誤區(qū)二:real-timePCR儀無(wú)需梯度功能

 

對(duì)于使用染料法的定量PCR反應(yīng),雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度(Tm值),但運(yùn)用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差異會(huì)很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化,對(duì)于特殊片斷,經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,退火溫度細(xì)微的差異對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問(wèn)題——在反應(yīng)過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化,根據(jù)結(jié)果,一步就可以摸索出適合的反應(yīng)條件。

 

不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增的多數(shù)高保真Taq酶來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要,因?yàn)門(mén)aq和校正酶的反應(yīng)溫度可能有顯著差異,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。

 

使用有梯度功能的二手熒光定量PCR儀可以一次完成以往多次實(shí)驗(yàn)才能完成的優(yōu)化過(guò)程,簡(jiǎn)化了摸索PCR反應(yīng)條件的繁瑣實(shí)驗(yàn),既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提率,又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

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