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液相色譜法檢測(cè)棉籽粕中的氨基酸

更新時(shí)間:2012-02-29      點(diǎn)擊次數(shù):4632

摘要:采用柱前衍生反相液相色譜法分析棉籽粕中十八中氨基酸,衍生試劑為優(yōu)選的某試劑,流動(dòng)相為醋酸鹽緩沖溶液、乙腈、水,二元梯度洗脫,色譜柱為AAK氨基酸柱,紫外檢測(cè)。該方法使用液相色譜儀,定性重復(fù)性好,定量準(zhǔn)確。

    關(guān)鍵詞:液相色譜、氨基酸、棉籽粕

*,蛋白質(zhì)是飼料中zui主要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)之一,動(dòng)物通過(guò)從飼料中攫取蛋白質(zhì),在其腸道中被分解成氨基酸而被機(jī)體吸收,從而合成自身的蛋白質(zhì),滿足機(jī)體自身的生長(zhǎng)發(fā)育的需要,因此,飼料中充足的蛋白質(zhì)有利于動(dòng)物機(jī)體充分發(fā)揮生長(zhǎng)潛能。由于蛋白質(zhì)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值z(mì)ui為根本的決定因素是其氨基酸組成,因此近年來(lái)越來(lái)越多的企業(yè)注重對(duì)蛋白質(zhì)飼料氨基酸組成的分析,從氨基酸水平上評(píng)估蛋白質(zhì)飼料及配合飼料的品質(zhì)。

我國(guó)長(zhǎng)江、黃河中下游和新疆地區(qū)為棉花主產(chǎn)區(qū),每年可提供約600萬(wàn)噸棉籽,制油后棉籽餅粕總產(chǎn)量約300萬(wàn)噸,故棉籽粕是我國(guó)重要的蛋白質(zhì)飼料資源。棉籽粕含有的粗蛋白可達(dá)40%以上。棉籽粕作為蛋白質(zhì)飼料的主要資源之一,除了要關(guān)注它的蛋白質(zhì)含量,對(duì)其氨基酸組成的分析也成為關(guān)注的焦點(diǎn)。

目前,飼料中氨基酸的測(cè)定主要是根據(jù)GB/T 18246-2000 《飼料中氨基酸的測(cè)定》方法來(lái)測(cè)定的,該方法是利用氨基酸分析儀來(lái)測(cè)定的,且對(duì)各種不同的氨基酸前處理方法不同,前處理方法比較復(fù)雜。

本文利用優(yōu)選的衍生試劑,通過(guò)柱前衍生,利用液相色譜來(lái)分析棉籽粕中的十八種氨基酸。

1         實(shí)驗(yàn)部分

1.1    儀器及試劑

1.1.1         試劑及試劑的配制

1.1.1.1    乙腈(色譜純);

1.1.1.2 水(超純水);

1.1.1.3 醋酸鈉(分析純);

1.1.1.4 冰乙酸(分析純);

1.1.1.5 *(分析純);

1.1.1.6 N,N-二甲基甲酰胺(分析純);

1.1.1.7 碳酸氫鈉(優(yōu)級(jí)純);

1.1.1.8 磷酸二氫鉀(優(yōu)級(jí)純);

1.1.1.9 氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純);

1.1.1.10 色氨酸標(biāo)樣(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心);

1.1.1.11 17種氨基酸混合標(biāo)樣(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心,混合標(biāo)樣中17種氨基酸的濃度見表一);

表一 十七種氨基酸標(biāo)樣中各氨基酸濃度

中文名稱

簡(jiǎn)稱

分子量

濃度

μmol/mL

濃度

mg/100mL

天冬氨酸

Asp

133.1

2

26.62

谷氨酸

Glu

147.1

2

29.42

絲氨酸

Ser

105.1

2

21.02

精氨酸

Arg

174.2

2

34.84

甘氨酸

Gly

75.1

2

15.01

蘇氨酸

Thr

119.1

2

23.82

脯氨酸

Pro

115.1

4

46.05

丙氨酸

Ala

89.1

2

17.82

纈氨酸

Val

117.1

2

23.44

蛋氨酸

Met

149.2

2

29.84

半胱氨酸

Cys

121.2

2

24.24

異亮氨酸

Ile

131.2

2

26.24

亮氨酸

Leu

131.2

2

26.24

苯丙氨酸

Phe

165.2

2

33.04

組氨酸

His

155.2

2

31.04

賴氨酸

Lys

146.2

2

29.24

酪氨酸

Tyr

181.2

2

36.24

1.1.1.12 飼料參比(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心,飼料參比的百分含量見表二);

 

表二 飼料參比的百分含量

序號(hào)

中文名稱

簡(jiǎn)稱

百分含量(%

1

天冬氨酸

Asp

1.56

2

谷氨酸

Glu

3.24

3

絲氨酸

Ser

0.94

4

精氨酸

Arg

1.25

5

甘氨酸

Gly

1.28

6

蘇氨酸

Thr

0.74

7

脯氨酸

Pro

1.40

8

丙氨酸

Ala

1.18

9

纈氨酸

Val

0.92

10

蛋氨酸

Met

0.54

11

半胱氨酸

Cys

0.34

12

異亮氨酸

Ile

0.76

13

亮氨酸

Leu

1.68

14

苯丙氨酸

Phe

1.00

15

組氨酸

His

0.50

16

賴氨酸

Lys

1.08

17

酪氨酸

Tyr

0.65

合計(jì)

 

 

19.06

1.1.1.13 色氨酸標(biāo)樣配制:稱取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,用氫氧化鈉溶液溶解配制成濃度為2μmol/mL溶液,即20.42mg/100mL

1.1.1.14 6 mol/L鹽酸配制:用濃鹽酸和水11配置即可;

1.1.1.15 5 mol/L氫氧化鈉的配制:稱取200g氫氧化鈉配成1L水溶液;

1.1.1.16 0.1mol/L氫氧化鈉溶液:稱取0.4g氫氧化鈉配成100mL水溶液;

1.1.1.17 衍生緩沖液:4%碳酸氫鈉水溶液;

1.1.1.18 衍生試劑:適量衍生試劑用乙腈定容為100mL

1.1.1.19 平衡緩沖液:0.68%磷酸二氫鉀水溶液。

1.1.2 儀器

液相色譜儀

大連依利特AAK氨基酸柱(4.6mm×250mm

水解管:硬質(zhì)玻璃管,體積2030mL

恒溫干燥箱、真空泵、漩渦混勻器、酒精噴燈等

1.2    儀器條件

測(cè) 器:紫外可見檢測(cè)器;

檢測(cè)波長(zhǎng):360nm

柱: AAK氨基酸柱(4.6mm×250mm);

動(dòng) 相:流動(dòng)相A:乙腈:水=11;

流動(dòng)相 B0.05mol/L醋酸鈉溶液(稱取4.1g醋酸鈉,0.4g*,加水900mL溶解,加入10mL N,N-二甲基甲酰胺,用冰乙酸調(diào)pH值為6.4,用水定容為1000mL);

流速:1.2mL/min;

柱溫:27

進(jìn)樣量:20μL。

表三 梯度洗脫時(shí)間表

時(shí)間(min

0

0.3

4

9.5

17

20

28

34

37

38

流動(dòng)相A

16

16

31

36

55

55

65

100

100

16

流動(dòng)相B

84

84

69

64

45

45

35

0

0

84

 

1.3    樣品處理過(guò)程

1.3.1 樣品和飼料參比水解:

1.3.1.1 對(duì)于除色氨酸以外的十七種氨基酸用酸水解:準(zhǔn)確稱量粉碎混勻的樣品適量,使樣品氨基酸總量在約100mg范圍內(nèi),置于水解管中,加入6mol/L鹽酸10mL左右,用酒精    

噴燈封口,然后放入145的烘箱中水解4h,取出冷卻后,打開水解管封口,將水解液全部用濾紙過(guò)濾到50mL的容量瓶中,用水定容至刻度,混勻,供衍生使用。

1.3.1.2 對(duì)于色氨酸用堿水解:準(zhǔn)確稱量粉碎混勻的樣品適量,使樣品氨基酸總量在約100mg范圍內(nèi),置于于水解管中,加入5mol/L氫氧化鈉10mL左右,放置30min以后,用酒精噴燈封口,然后放入145的烘箱中水解4h,取出冷卻后,將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL的容量瓶中,先用6mol/L鹽酸10mL左右中和,再用水定容至刻度,混勻,供衍生使用。

1.3.1.3 由于酸水解過(guò)程中含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)部分被氧化不能測(cè)準(zhǔn),所以要用飼料參比來(lái)加以校正,飼料參比用酸水解:準(zhǔn)確稱量粉碎混勻的樣品適量,使樣品氨基酸總量在60100mg范圍內(nèi),置于水解管中,加入6mol/L鹽酸10mL左右,用酒精噴燈封口,然后放入145的烘箱中水解4h,取出冷卻后,打開水解管封口,將水解液全部用濾紙過(guò)濾到50mL的容量瓶中,用水定容至刻度,混勻,供衍生使用。

1.3.2 標(biāo)樣和樣品衍生

1.3.2.1 十七種氨基酸標(biāo)樣、飼料參比和樣品酸水解的水解液的衍生過(guò)程:用注射器準(zhǔn)確吸取樣品水解液適量于小試管底部中;將小試管置于真空瓶或者真空干燥器中,抽干;用移液槍加入適量衍生緩沖液,漩渦混合;用移液槍加入定量衍生試劑,漩渦混合,用封口膜封口,置于60烘箱中反應(yīng)30min;取出冷卻后用移液槍加入160μL平衡緩沖液,漩渦混合,取20μL進(jìn)樣。

1.3.2.2 色氨酸標(biāo)樣、樣品堿水解的水解液的衍生過(guò)程:用注射器準(zhǔn)確吸取樣品水解液適量于小試管底部;將小試管置于真空瓶或者真空干燥器中,抽干;用移液槍加入適量衍生緩沖液,漩渦混合;用移液槍加入定量衍生試劑,漩渦混合,用封口膜封口,置于60烘箱中反應(yīng)30min;取出冷卻后用移液槍加入160μL平衡緩沖液,漩渦混合,取20μL進(jìn)樣。

2         結(jié)果與討論

2.1 專屬性

圖一 十七種氨基酸的色譜圖

十七種氨基酸的出峰順序:1、天冬氨酸;2、谷氨酸;3、絲氨酸;4、精氨酸;5、甘氨酸;6、蘇氨酸;7、脯氨酸;8、丙氨酸;9、纈氨酸;10、蛋氨酸;11、胱氨酸;12、異亮氨酸;13、亮氨酸;14、苯丙氨酸;15、組氨酸;16、賴氨酸;17、酪氨酸。

從圖一中可以看出,除了苯丙氨酸和組氨酸沒有分開之外,其余各峰均分離良好,苯丙氨酸和組氨酸可以用切分峰的方法進(jìn)行計(jì)算。

2.2 飼料參比的作用

由于酸水解過(guò)程中含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)部分被氧化而不能測(cè)準(zhǔn),所以要用飼料參比來(lái)加以校正。校正的方法是,通過(guò)用飼料參比中蛋氨酸和半胱氨酸的含量來(lái)校正標(biāo)樣中蛋氨酸和半胱氨酸的濃度含量,從而使得標(biāo)樣中蛋氨酸和半胱氨酸的含量準(zhǔn)確,再用標(biāo)樣去定量樣品中氨基酸含量。

2.3 色氨酸的檢測(cè)

    色氨酸用提供的色譜條件就可以進(jìn)行檢測(cè),可以得到分離良好的色譜圖,如圖二所示:

圖二 色氨酸色譜圖

2.4 棉籽粕樣品的分析結(jié)果

新疆棉籽粕的粗蛋白含量基本在42%~46%之間,此類棉籽粕的粗蛋白含量是很高的,很適合于做蛋白質(zhì)飼料,能夠測(cè)出此類棉籽粕的各種氨基酸的含量,尤其是必需氨基酸(賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸等)的含量,可以以此來(lái)評(píng)價(jià)棉粕的品質(zhì),并且可以為配合氨基酸成分平衡的飼料提供參考依據(jù)。表三 為新疆金鑫科技棉籽粕樣品的氨基酸分析結(jié)果。

表四  新疆金鑫科技棉籽粕樣品的氨基酸分析結(jié)果

中文名稱

簡(jiǎn)稱

百分含量(%

天冬氨酸

Asp

3.75

谷氨酸

Glu

8.80

絲氨酸

Ser

1.43

精氨酸

Arg

4.04

甘氨酸

Gly

2.11

蘇氨酸

Thr

1.11

脯氨酸

Pro

1.73

丙氨酸

Ala

1.66

纈氨酸

Val

2.02

蛋氨酸

Met

0.50

半胱氨酸

Cys

0.80

異亮氨酸

Ile

1.43

亮氨酸

Leu

2.46

苯丙氨酸

Phe

1.78

組氨酸

His

1.14

賴氨酸

Lys

1.80

酪氨酸

Tyr

0.90

色氨酸

Trp

0.39

測(cè)定氨基酸總計(jì)

 

37.85

粗蛋白

 

44.61

 

3         結(jié)論

    通過(guò)酸水解前處理的方法和飼料參比校正的數(shù)據(jù)處理可以同時(shí)檢測(cè)棉籽粕中十七種氨基酸,通過(guò)堿水解的方法可以檢測(cè)棉籽粕中的色氨酸。該衍生化方法簡(jiǎn)便、產(chǎn)物穩(wěn)定,過(guò)量的衍生化試劑以及反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物對(duì)檢測(cè)沒有影響。二元高壓系統(tǒng)流量精度高,保留時(shí)間重復(fù)性好,紫外檢測(cè)器性能穩(wěn)定。該方法可廣泛應(yīng)用于飼料、食品、生化、醫(yī)藥等分析領(lǐng)域。

 

 

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